外泌體收集與寄送要求

注意事項：

● 采集的樣本需要符合納入標準：如年齡、肥胖（身高、體重）、血糖血脂血壓、診斷情況 等。

● 統一早晨空腹采血，盡量避免樣本間的差異影響。

● 如個(gè)別樣本發(fā)生溶血，則棄掉。

● 樣本編號用油性筆清楚地寫(xiě)在管壁及管蓋上。

● 離心管在放入冰箱前，用封口膜密封。 

● 如果提供的是凍存細胞株，需提供詳盡的復蘇方法。 

● 細胞培養基必須使用去除 exosome（de-exosome）的血清或者無(wú)血清培養基（例如 Thermo Fisher 的 SFM）。 

● 分離外泌體前的樣品不能加入任何 RNA 保護劑（如 Trizol）。

● 分離好的外泌體如需進(jìn)行電鏡觀(guān)察，需要放 4°C 保存，并且不宜保存太久。 

● 全血建議使用 PAXgene 管保存，不可凍融，取血后盡早制備血漿或血清，血漿或血清可 以-80°C 保存，但應避免反復凍融。

● 儲存條件以及儲存時(shí)間影響外泌體得率，保存在-80℃冰箱中的樣本，如果儲存時(shí)間過(guò)長(cháng)， 外泌體產(chǎn)量也會(huì )顯著(zhù)降低。 

● 干冰運輸應采用壁厚且質(zhì)量完好的泡沫箱，24 小時(shí)到達的，干冰數量不得低于 5 公斤； 48 小時(shí)到達的，干冰數量不得低于 8 公斤；夏季適當增加干冰（1.5 倍）。

常見(jiàn)實(shí)驗問(wèn)題： 

1.血漿（plasma）還是血清(serum)？

       對于大多數涉及到 Exosome RNA 分離的研究，我們推薦使用血漿（plasma）。因為血清收集 后在凝血過(guò)程中，血小板受到刺激會(huì )產(chǎn)生許多 Exosome 和其他形式的小泡，因此血清中獲得 的小泡始終比血漿中多，甚至超過(guò) 50%的小泡來(lái)源于血小板。所以血漿是研究病理生理狀態(tài) 下 Exosome 更好的介質(zhì)。多數的 criculating Exosome 研究樣本使用的是血漿。負壓采血之 后，血液首先存放入采血管，去除止血帶，最初的幾毫升不要，因為有壓力激活效應，并且 被成纖維細胞污染。血液收集應該輕柔并且迅速。顛倒混勻采血管 8-10 次，與管壁上的抗 凝劑混合，但不要為了抗凝而劇烈搖動(dòng)。離心前管子應該垂直存放，并記錄實(shí)驗室中存放的 時(shí)間，因為從采血到離心除去細胞和血小板這中間的過(guò)程很重要，建議在 30min 內完成，長(cháng) 時(shí)間的存放，而沒(méi)有及時(shí)處理會(huì )導致血小板細胞 Exosome 的進(jìn)一步釋放。血液要盡快處理， 在室溫條件下分離血漿（或者血清）。所有樣品要使用相同的轉速和轉子類(lèi)型離心。 

2.怎樣選擇抗凝劑（anticoagulant）？ 

         抗凝劑有一個(gè)或多個(gè)形式的功能,包括螯合鈣、蛋白酶抑制和抑制血小板活化。有許多抗凝 血劑可用，但不建議使用肝素（heparin）抗凝劑。無(wú)論是外源性或內源性起源（例如肥大 細胞），肝素會(huì )抑制下游 PCR 反應，因為肝素會(huì )與引物和酶競爭與核酸結合。另外,肝素可抑 制 Exosome 與靶細胞的結合,抑制 Exosome 激活血小板或降低血小板激活閾值。應用肝素治 療的病人也應該注意。 對于珍貴樣本，可能需要從肝素化的血液樣品中提取 RNA。核酸的 檢測需要通過(guò)調整 PCR 的敏感性。另外如果 Exosome 相關(guān)核酸被發(fā)現只存在于 Exosome 內, 在 RNA 分離之前的洗滌也可以幫助去除肝素。其它抗凝劑如 EDTA、氟化鈉/草酸鉀(NaF/KOx), 或檸檬酸三鈉[加入/不加右旋糖 dextrose(ACD)或茶堿(theophylline)、腺苷(adenosine) 和雙嘧達莫(CTAD)]就更復雜了，最好根據下游的實(shí)驗來(lái)指導。CTAD 阻礙血小板活化和隨后 的 Exosome 釋放。EDTA 可干擾 PCR 反應(盡管程度低于肝素),但它的存在可能是無(wú)害的。另 外,下游實(shí)驗的選擇需要考慮到抗凝劑的使用種類(lèi)。不同的聚合酶對抑制劑有不同的敏感性。 

3.靜脈取血過(guò)程應該注意什么? 

       在血液處理過(guò)程中，由于物理作用力，血小板中的 Exosome 容易在處理過(guò)程中釋放，這些外 力包括：接觸、壓力、剪切力，所以標準化的樣品處理，需要統一的注射器型號以及其他操 作。使用 21 號針頭或者更大號的針頭可以避免靜脈取血剪切力引起的不良效應。負壓采血 之后，血液首先存放入采血管，去除止血帶，最初的幾毫升不要，因為有壓力激活效應，并 且被成纖維細胞污染。血液收集應該輕柔并且迅速顛倒混勻采血管 8-10 次，與管壁上的抗 凝劑混合，但不要為了抗凝而劇烈搖動(dòng)。

 4.樣本受晝夜節律，采血時(shí)間和飲食狀態(tài)的影響嗎？ 

       血液學(xué)參數在人體的一天之中是有變化的，血液粘稠度的輕微變化在幾十年前就已發(fā)現。最 近發(fā)現，晝夜節律對于血小板的激活具有很大的影響，而且比壓力（包括鍛煉身體）的影響 還要大。 白細胞穿梭以及在促炎癥因子和抗炎癥因子在血液循環(huán)中存在也在一天當中有變 化。因此，對于 Exosome 的研究，在實(shí)驗設計上，需要有嚴格的對照，采血時(shí)間在晝夜節律 上的一致才能更容易的比較樣本差異。此外，還需要考慮，樣本來(lái)源人體在正常睡眠/蘇醒 周期上的差異性。食物對于 Exosome 的影響目前還不知道，但是因為脂蛋白載著(zhù) RNA，食物 的吸收影響血液循環(huán)中脂蛋白顆粒的類(lèi)型、數量和功能，因此采血可以在飯后一個(gè)統一的時(shí) 間點(diǎn)進(jìn)行，進(jìn)食記錄也是很有價(jià)值的。

 5.還需要額外的數據收集嗎? 

       來(lái)自血液其他數據對于分析病理生理作用也是很有意義的，有時(shí)可能還需要分離其它細胞如 白細胞或者血清游離 DNA/RNA 作為 Exosome 的對照，有時(shí)需要流式細胞術(shù)配合抗體對細胞分 選或分析，確定血液細胞組分的比例。血中 Exosome 可能來(lái)自其他組織器官，有時(shí)需要從同 一個(gè)患者身上得到多種體液與血液進(jìn)行對比，例如腦脊液(CSF)和血漿樣本。 

6.溶血是否影響結果？

        一般溶血樣本通過(guò)顏色就可以看出來(lái)，如果必要可通過(guò)分光光度計和血紅蛋白釋放實(shí)驗測量。 當分析總 exRNA，溶血的血液制品含有高濃度的特定 RNA，其中包括 miR-16 和 miR-451 等， 還有待確定 RNA 以這種方式釋放是否會(huì )干擾 exRNA 分析結果。 

7.血液樣本需要記錄哪些信息？ 

       國際細胞外囊泡學(xué)會(huì )(International Society for Extracellular Vesicles, ISEV)推薦記 錄如下信息： 

      采血時(shí)間 

      采血針的類(lèi)型/其他配件 

      抗凝管的類(lèi)型 

      起始棄去的血液有多少？

      止血帶是否移除迅速？ 

      采血時(shí)間和離心時(shí)間間隔有多久？ 

      處理注意事項（樣本是否保持垂直？是否室溫存放？） 

      是否溶血和檢測方法？ 

      樣本處理細節（轉子類(lèi)型、離心力、離心時(shí)間） 樣本分裝細節和存放 細胞是否分離？ 

      全血計數？ 

      流式檢測？ 

      是否還進(jìn)行其他血液檢測？ 

      是否有匹配的其他樣本收集（比如血漿和血清，尿液，鼻液，口水等）

      是否有病人親屬樣本作為對照 

常見(jiàn)樣本問(wèn)題:

1、分離方法適用于哪些種類(lèi)樣品中的外泌體提��？ 

     可用于細胞上清液、血清、血漿、尿液及其他低密度體液（如腦脊液、腹水、羊水、乳汁、 唾液等）的外泌體提取。 

2、樣品在提取外泌體之前是否可以低溫保存？ 

      可以。血樣、尿樣、體液等，需要攢齊了一起提取，或者同一個(gè)患者的樣本多次提取。凍存 前，首先要離心去除細胞和血小板，再將樣品分裝凍存于-20 或-80℃。但如果有條件最好 還是用新鮮樣品立即進(jìn)行提取。長(cháng)期請保存于-80℃，無(wú)須加凍存液；短期（1-2 天內）則 保存于 4℃即可。

3、外泌體提取后是否可以?xún)龃妫?/strong> 

      可以。使用硅化 E.P.管或凍存管，減少 exosome 的粘附。Exosome 能夠承受反復凍融，建議 分裝，避免多次反復凍融。對于一些功能性實(shí)驗，建議不要凍存，直接使用新鮮提取或保存 在 4℃懸浮于 PBS 中的 exosome。4℃保存不超過(guò)一周，-80℃條件下可長(cháng)期保存。 

4、需要從血漿中分離外泌體，可以使用肝素或 EDTA 管去收集血液樣本嗎？ 

       不可以。肝素將會(huì )大大損害接下來(lái)的 RNA 實(shí)驗。EDTA 也許會(huì )干擾 PCR 實(shí)驗。使用無(wú)肝素無(wú) EDTA 管去收集血液樣本。立即離心樣品收集血漿用于 exosome 分離。如果必須使用抗凝劑， 用 EDTA 管收集血液。如果有必要的話(huà)在接下來(lái)的 PCR 反應中調整 Mg++的濃度。采血管的選 擇：血漿（plasma）：紫蓋采血管；血清（serum）：黃蓋采血管（促凝管或促凝管帶分離膠）。

 5、粘度過(guò)大的樣品如何處理？ 

       如果樣品粘度過(guò)大時(shí)（因細胞分泌物較多所致），可將樣品用 1×PBS 緩沖液進(jìn)行等體積稀釋。 

6、培養細胞時(shí)，如何去除血清來(lái)源的外泌體？

      多數情況下，細胞在體外培時(shí)養需要血清，而血清中一般都含有外泌體，為避免血清對細胞 外泌體的污染，可采用以下兩種方法： （1）將細胞培養用的血清通過(guò) 1×105g 超速離心 10h 以去除血清外泌體； （2）選擇無(wú)血清培養基進(jìn)行細胞培養。

 7、無(wú)外泌體血清培養基（或者無(wú)血清培養基）在什么時(shí)候使用？

       細胞在正常含血清的培養基中培養一定的時(shí)間后，細胞融合度約為 60%-70%時(shí)，移去原有含 血清的培養基，換成新鮮的無(wú)外泌體血清培養基（或者無(wú)血清培養基），繼續培養 24-48h， 細胞融合度達到 80%-95%左右時(shí)收取上清,該上清液即可用于提取外泌體。 

8、細胞培養過(guò)程中的死細胞是否會(huì )影響外泌體的提��？

     會(huì )的。在收獲細胞時(shí)，應確定死亡細胞占比不超過(guò) 5%。細胞凋亡/死亡過(guò)程中會(huì )釋放大量大 小不等的囊泡，它們在外泌體的提取純化過(guò)程中會(huì )污染活細胞產(chǎn)生的外泌體。

9、如何鑒定提取的外泌體？

       通常使用透射電鏡檢測（形態(tài)）、粒徑檢測（大�。�、Western blot 檢測等方法鑒定提取的 外泌體。在進(jìn)行 Western blot 檢測時(shí)，通常檢測外泌體標志蛋白（CD63、CD9、CD81、TSG101 等），按照國際細胞外囊泡協(xié)會(huì )的建議為檢測 2 個(gè)陽(yáng)性和 1 個(gè)陰性指標。

10、準備做細胞外泌體 Small RNA 的 NGS 測序，初始樣品量需要準備多少？

       普通腫瘤細胞系推薦使用 40mL 以上的初始樣品量。由于某些細胞（如懸浮細胞、干細胞、 神經(jīng)細胞等）中外泌體含量比較低，建議先通過(guò) 10kD 超濾柱濃縮，準備 40mL 以上的濃縮液 再進(jìn)行超速離心分離外泌體，一般需提取到 20ng 以上的 Total RNA。

11、進(jìn)行外泌體 RNA RT-PCR 實(shí)驗推薦什么內參？

       取決于具體樣品，可以選擇外源添加 cel-miR-39-3p，或內源 U6、SNORD61、SNORD68、SNORD72 作為內參。

12、提取的外泌體進(jìn)行 Western blot 前是否需要加入 RIPA 試劑裂解？ 

       需要，一般按照 1:1 的比例加入 RIPA 試劑。 

13、進(jìn)行外泌體 Western blot 鑒定時(shí)有無(wú)內參蛋白可供選擇？ 

        無(wú)，該檢測屬于定性檢測。

14、組織細胞外泌體如何提��？ 

無(wú)菌環(huán)境下將組織剪成小塊（越小越好），然后在無(wú)血清的培養基中培養 12h；將培養液轉 移至離心管中，于 4℃以 3000g 離心 20 min 去除培養液中雜質(zhì)和細胞碎片，將上清液轉移 至新的離心管中；先使用 0.45μm 濾器過(guò)濾上清液，接著(zhù)使用 0.2μm 濾器過(guò)濾上清液，再 進(jìn)行超速離心分離外泌體。有條件的話(huà)建議采用 Transwell 小室培養的方式，效果更佳。