細胞透射電鏡取材實(shí)驗注意事項

1、細胞樣品取材原則：

  細胞樣品結構簡(jiǎn)單，一般分為懸浮培養及貼壁培養。貼壁培養建議使用6cm-10cm的培養皿培養，這樣有足夠的細胞量且方便操作。取材前，先查閱文獻，明確實(shí)驗目的，設計好實(shí)驗流程，熟悉超微結構及分布，對需要觀(guān)察的結構及特點(diǎn)需要有自己的判斷，根據不同的實(shí)驗目的，制定取材計劃。另外，戊二醛會(huì )影響抗原活性，如果課題需要做免疫性的實(shí)驗，取材時(shí)需要用不同的固定液固定。固定對取材用器材及試劑，進(jìn)行清潔及預冷，寫(xiě)好取材的標簽。取材時(shí)，務(wù)必做到相同條件下取材，相同人員平行操作。固定液一般為2.5%電鏡專(zhuān)用戊二醛。

2、取材器材與試劑：

  冰盒、EP管、2.5%戊二醛、封口膜、吸管。均4度預冷備用。

3、細胞取材操作方法：

  3.1刮:將狀態(tài)良好，處理完畢的細胞。連著(zhù)培養液直接用細胞刮刀沿培養皿邊緣由一個(gè)方向一次性刮下，不要反復來(lái)回刮，也不要用胰酶消化。反復來(lái)回刮會(huì )導致細胞損傷嚴重，結構被破壞。消化法更是會(huì )造成整體細胞結構改變，自噬假陽(yáng)性、破壞細胞間緊密連接、線(xiàn)粒體損傷等。懸浮細胞可以理解為刮下的細胞懸液。

  3.2離：對細胞狀態(tài)，觀(guān)察的結構及過(guò)程要有大概了解。常規自噬、線(xiàn)粒體等觀(guān)察直接刮下后轉移到15ml離心管中，1000-3000rpm低速離心，目的是富集細胞。轉速越低越好，時(shí)間越短越好。期間對于凋亡、壞死等實(shí)驗，取材時(shí)，需要將細胞上清中漂浮的細胞或碎片收集。很有可能這些漂浮的細胞及碎片是凋亡、壞死程度較高，超微結構最為典型的。

  3.3洗:刮下細胞后，需要用PBS將細胞洗2次，主要目的是去除殘留的培養基，提高成像效果，但這個(gè)過(guò)程不是必須的。在這個(gè)過(guò)程中，細胞處于饑餓狀態(tài)，操作一定要迅速，對于敏感的細胞（神經(jīng)元、心肌細胞等），可以不洗。否則會(huì )導致結構改變。

  3.4冷:全程4℃操作、保存、送樣。盡量在低溫下操作，降低水解酶的活性，所用容器和器械應預冷，取好的標本放在4℃冰箱保存。