冷凍電鏡樣品制備常規方法

　　在低溫下用透射電子顯微鏡觀(guān)察樣品的顯微技術(shù)叫冷凍電鏡技術(shù)。當用戶(hù)拍攝獲得樣品顆粒的足夠多數量的高質(zhì)量電鏡照片后，即可由計算機三維重構技術(shù)解析得到樣品顆粒的三維結構。自從前幾年冷凍電鏡技術(shù)突破（直接電子檢測器、圖像漂移校正、三維重構技術(shù)等）后，冷凍電鏡技術(shù)已成為結構生物學(xué)領(lǐng)域重要的結構解析技術(shù)，它特別適合用于解析一些大分子量的、難以結晶的生物大分子結構。且最近幾年，冷凍電鏡解析得到的生物分子的結構分辨率已可達到原子級分辨率，它已成為一種和X-射線(xiàn)晶體學(xué)技術(shù)互補的重要的生物大分子結構解析技術(shù)。

　　冷凍電鏡實(shí)驗的第一步為冷凍電鏡樣品制備實(shí)驗，它是將溶液狀態(tài)下的樣品鋪展在銅網(wǎng)上，形成很薄的樣品液層（液層厚度取決于樣品顆粒大�。�，然后再將銅網(wǎng)投入液態(tài)乙烷中進(jìn)行快速冷凍�？焖倮鋬龊蟮臉悠穼⑥D變成無(wú)定型狀態(tài)的冰（玻璃態(tài)的樣品），該狀態(tài)下的樣品中不含有冰晶，不會(huì )破壞生物樣品本身的結構，也不會(huì )導致電子衍射干擾數據收集�？焖倮鋬龊蟮臉悠穼ν干潆婄R中的電子輻射耐受能力大大提高，且冷凍后的樣品顆粒呈現的是樣品自然狀態(tài)下的形貌。

　　冷凍電鏡玻璃態(tài)樣品制備

　　上圖為冷凍電鏡玻璃態(tài)樣品制備的示意圖。首先我們選擇一張銅網(wǎng)作為冷凍電鏡觀(guān)察的載網(wǎng)，銅網(wǎng)一般為三層結構，由銅網(wǎng)骨架、方華膜和含有微米級小孔的碳膜組成。接著(zhù)我們把待測試樣品溶液滴在銅網(wǎng)上。一般來(lái)說(shuō)，滴在銅網(wǎng)上的樣品體積為3-5μL，樣品上了銅網(wǎng)后會(huì )鋪展開(kāi)來(lái)，不過(guò)此時(shí)銅網(wǎng)上的樣品液層厚度太厚，如果直接冷凍，冷凍劑很難將其凍透成玻璃態(tài)的樣品，上了電鏡后，也會(huì )因為電子束無(wú)法穿透厚厚的樣品，從而看到漆黑的一片。因此，在進(jìn)行快速冷凍前我們必須把銅網(wǎng)上多余的樣品給去除，常規方法為使用濾紙吸去多余的樣品，僅在銅網(wǎng)上留下一層非常薄的液體。通常來(lái)說(shuō)，這層液體的厚度略大于樣品顆粒的尺寸，常在納米級。如何控制實(shí)驗的變量，從而保證超薄液層制備成功，這就變成非常難又比較隨機的事情了。

　　冷凍電鏡銅網(wǎng)的結構及樣品在碳膜小孔中的分布

　　鑲嵌于銅網(wǎng)碳膜小孔內玻璃態(tài)樣品中的轉鐵蛋白顆粒

　　當完成銅網(wǎng)上超薄樣品液層的制備后，我們需要將銅網(wǎng)快速投入到液態(tài)乙烷中完成樣品的快速冷凍。為什么要選擇液態(tài)乙烷作為冷凍劑呢？這是因為液態(tài)乙烷有著(zhù)非常大的導熱速率，能夠在極短時(shí)間內將樣品溶液的溫度降低到玻璃態(tài)溫度，實(shí)現玻璃態(tài)樣品的制備。在完成玻璃態(tài)樣品制備后，我們可以將銅網(wǎng)由液態(tài)乙烷內轉移到液氮中進(jìn)行儲存，玻璃態(tài)的樣品在液氮的低溫中依舊能保持穩定存在，且方便進(jìn)行樣品的長(cháng)期儲存和運輸。

　　單顆粒冷凍電鏡技術(shù)介紹

　　通常來(lái)講，冷凍電鏡樣品制備實(shí)驗需要考慮到的參數有：環(huán)境濕度、環(huán)境溫度、濾紙按壓的時(shí)間和力度。制樣時(shí)的環(huán)境溫度將影響我們的生物樣品的穩定性，濾紙作為銅網(wǎng)上樣品減薄的工具，其按壓銅網(wǎng)的力度和時(shí)間非常影響樣品在銅網(wǎng)上的厚度。此外，為避免超薄樣品的蒸發(fā)，100%的制樣濕度也必不可少。當前冷凍電鏡樣品制備裝置可分為手動(dòng)制樣裝置和自動(dòng)化制樣機器人。

　　下圖展示了一種手動(dòng)制樣裝置。手動(dòng)制樣裝置結構簡(jiǎn)單，通常含有一個(gè)可上下往復運動(dòng)的軸（通常為壓縮空氣驅動(dòng)），用于帶動(dòng)鑷子的上下運動(dòng)，從而實(shí)現將銅網(wǎng)投入裝置下方裝有冷凍劑的杜瓦中。銅網(wǎng)上多余的樣品的吸除也是依靠濾紙按壓來(lái)完成，因為是手動(dòng)完成的操作，所以實(shí)驗的重現性很差，不能保證每次做出來(lái)的結果都相同。

　　一種手動(dòng)的冷凍電鏡制樣裝置

　　目前主流的冷凍電鏡樣品制備方法是依靠自動(dòng)化的制樣機器人來(lái)完成的，如下圖所示。這類(lèi)機器人都具有一個(gè)密閉的制樣室，用于提供一個(gè)溫度和濕度可控的制樣環(huán)境。其樣品減薄依然是采用濾紙按壓的方式來(lái)實(shí)現的。機器人還有一個(gè)機械臂（軸），可以懸掛鑷子，在電機的驅動(dòng)下，可以高速將鑷子尖端插入冷凍劑中。其主要的制樣流程是：先設置好制樣室的濕度和溫度，使得我們的樣品可以維持穩定；設置好制樣參數，如濾紙按壓的時(shí)間和力度，等待時(shí)間等；然后將夾有銅網(wǎng)的鑷子安裝到機器人的機械臂上，使得銅網(wǎng)處于制樣室內；用移液槍將3-5μL樣品注射到銅網(wǎng)上，后續的實(shí)驗操作（濾紙按壓、銅網(wǎng)的冷凍）機器人將按照預先設定的程序自動(dòng)完成。用機器人進(jìn)行實(shí)驗可獲得較好的重現性，因此目前各大冷凍電鏡中心都采用制樣機器人來(lái)進(jìn)行實(shí)驗。

　　總的來(lái)說(shuō)，自動(dòng)化的冷凍電鏡機器人縮短了冷凍電鏡樣品制備的耗時(shí)，在一定程度上提升了冷凍電鏡樣品制備實(shí)驗的重現性，但其仍存在一些缺點(diǎn)。如，銅網(wǎng)上幾乎99%的樣品在制樣過(guò)程中被濾紙吸走，存在樣品浪費的情況；用濾紙按壓實(shí)現樣品減薄在很大程度上難以控制，制樣實(shí)驗需摸索的參數較多，樣品液層厚度不可控。