Q：見(jiàn)外泌體來(lái)源類(lèi)型樣本的收集方法

　　俗語(yǔ)說(shuō)，良好的開(kāi)端是成功的一半，領(lǐng)先一步，占盡先機！對于外泌體研究，一步也是相當重要的一步就是收集制備外泌體樣本，那么如何有效地收集各種類(lèi)型的樣本用于后續的外泌體分離呢？關(guān)于不同的試驗、不同的樣品，取樣的注意事項有哪些呢？又需要經(jīng)過(guò)哪些預處理才能保存呢？下面小編將與大家一起來(lái)探討上述介紹的最常見(jiàn)外泌體來(lái)源類(lèi)型樣本的收集方法。

　　01.細胞上清Cell culture supernatant--關(guān)于細胞培養上清液，首先需要確定的是細胞的身份驗證以及支原體與微生物污染。國際細胞外囊泡協(xié)會(huì )于2018年在會(huì )刊Journal of Extracellular Vesicles發(fā)表了新版的《指導要求》，即《MISEV 2018》(下載全文)。在描述收集和預處理過(guò)程中需要注意的可控變量中，注明所有細胞研究都建議采取一些預防措施，如定期確認細胞身份（短串聯(lián)重復序列STR分析或其他方法），鑒定細胞品系和來(lái)源。另外需要定期檢測支原體、微生物污染，不僅因為污染對細胞的影響，還有污染物也會(huì )分泌細胞外囊泡（詳細信息查閱：外泌體研究之細胞鑒定）。

　　另外需要注意的是：細胞培養基必須使用去除exosome的血清（如去外泌體胎牛血清,Exosome depleted Fetal Bovine Serum,VivaCell P/N:C38010050）或者無(wú)血清培養基，以降低背景值的干擾（牛血清中含有大量牛源外泌體）。

　　1)細胞在正常含有血清的培養基中培養一定時(shí)間，細胞增長(cháng)至約70%；

　　2)對于貼壁細胞，去除原有培養基，用PBS洗滌，更換新的含去外泌體血清的培養基或者無(wú)血清培養基；對于懸浮細胞，300×g，4℃，10分鐘收集細胞，用PBS洗滌，使用不含外泌體的培養基或者無(wú)血清培養基懸浮細胞并繼續培養；

　　3)細胞繼續培養24-48小時(shí)，根據細胞的生長(cháng)速度確定收取上清時(shí)間；

　　4)收集細胞上清，300×g，4℃，離心10分鐘；小心吸取上清，注意避免吸入細胞或者細胞碎片；

　　5)上清0.22μm過(guò)濾，去除細胞碎片、凋亡小體和微囊泡；

　　6)將上清樣本凍存于-80℃。

　　建議送樣量：20ml以上

　　02血漿Plasma

　　1)取全血至EDTA抗凝管中，輕柔混勻；

　　2)4°C條件下，2500×g，離心15min，取上清；

　　3)再次2500×g，離心15min，取上清即為血漿；

　　4)血漿于-80°C保存。

　　建議送樣量：2ml以上

　　03血清Serum

　　1)將4ml全血置于普通采血管中（注意收集血清樣本不要加入抗凝劑）37℃凝固20-30 min；

　　2)2000×g離心10 min，取上清，淡黃色透明液體即為血清；

　　3)將血清置于-80°C保存。

　　建議送樣量：2ml以上

　　04尿液Urine

　　1)無(wú)菌容器收集清晨第一次尿液50ml；

　　2)加入蛋白酶抑制劑混合物（1.67 ml of100mM NaN3,2.5ml PMSF(2 mg/ml in isopropyl alcohol),50μl Leupeptin(1 mg/ml in ddH2O)）；

　　3)立即處理或置于-80°C保存。

　　建議送樣量：20ml以上

　　05腦脊液Cerebrospinal fluid

　　1)收集腦脊液，放置冰上靜置30min；

　　2)4℃，2000×g，離心10分鐘，去除細胞或細胞碎；

　　3)取上清，立即處理或置于-80°C保存。

　　建議送樣量：10ml以上