外泌體NTA結果怎么看？外泌體檢測

　　外泌體NTA結果怎么看？外泌體參與神經(jīng)疾病和癌癥等很多種疾病的病理過(guò)程，同時(shí)在正常的生理過(guò)程中也發(fā)揮著(zhù)介導細胞間通訊的重要功能。細胞外囊泡在臨床醫學(xué)中也有十分光明的應用前景，由于它們含有豐富的生物標志物，可用于監測疾病進(jìn)展，治療反應等，同時(shí)由于外泌體具有攜帶遞送生物分子的功能，具有成為臨床藥物遞送載體的潛力。外泌體的功能研究一步，即進(jìn)行外泌體的鑒定。

　　外泌體是由細胞分泌的直徑在30~150nm的膜性小囊泡，那么是否存在直徑大于150nm或與外泌體大小相近的其它膜性小囊泡呢？答案是肯定的。這里就要說(shuō)到細胞外囊泡（EVs），EVs是由細胞釋放的膜性小囊泡，直徑在30nm到9μm之間，根據直徑的大小，可細分為三大類(lèi)：外泌體（30~150nm）、微囊泡（100-1000nm）和凋亡小體（50-2000nm）。

　　國際細胞外囊泡學(xué)會(huì )（ISEV）在2014年提議，對于分離獲得的外泌體需要從三個(gè)層面進(jìn)行鑒定：（1）Western Blot（WB）鑒定外泌體表面標志物；（2）透射電鏡（TEM）鑒定外泌體形態(tài)；（3）粒徑分析（NTA）鑒定外泌體大小。

　　01.WB驗證：檢測外泌體標志蛋白的表達情況

　　鑒定外泌體首先需要通過(guò)WB來(lái)鑒定外泌體的標志蛋白是否存在于樣品中，外泌體形成于早期胞內體，在內吞體轉運復合體（ESCRT）及一些相關(guān)蛋白的調控下，早期胞內體發(fā)生內出芽形成多個(gè)腔內小囊泡，構成多胞體（MVB），MVB最后在GTPase家族中的RAB酶調解下與細胞膜融合向外界釋放囊泡。

　　外泌體膜上富含參與外泌體運輸的四跨膜蛋白家族（CD63、CD81和CD9)）、熱休克蛋白家族（(HSP60、HSP70、HSPA5、CCT2和HSP90)以及一些細胞特異性的蛋白包括A33（結腸上皮細胞來(lái)源）、MHC-II(抗原提呈細胞來(lái)源)、CD86(抗原提呈細胞來(lái)源)以及乳凝集素（不成熟的樹(shù)突狀細胞）。其中CD63、CD9、CD81以及TSG101、HSP70、ALIX等，是最常用到的細胞外囊泡標志物。

　　這些標志物蛋白其實(shí)主要是涉及到了囊泡的形成和分泌過(guò)程，他們產(chǎn)生于細胞中，定位于胞內的膜結構附近，如四旋蛋白（CD9，CD63和CD81），直接參與了細胞外囊泡內容物的分選；TSG101是ESCRT復合體相關(guān)的蛋白，而ESCRT復合體是膜形成和斷裂的驅動(dòng)器。ALIX直接涉及到了膜泡在形成過(guò)程中切割脫離質(zhì)膜形成獨立膜結構的過(guò)程。

　　02電鏡：分析外泌體的大小/形態(tài)等

　　掃描電鏡(scanning electron microscopy,SEM)或透射電鏡(transmission electron microscopy,TEM)等電子顯微鏡可用于外泌體鑒定。SEM的工作原理是用能量為1~30 KV間的電子束，以光柵狀掃描方式照射到被分析試樣的表面上，利用入射電子和試樣表面物質(zhì)相互作用所產(chǎn)生的二次電子和背散射電子成像，獲得試樣表面微觀(guān)組織結構和形貌的高分辨率信息。由于超高真空技術(shù)的發(fā)展，場(chǎng)發(fā)射電子槍的應用得到普及，現代先進(jìn)的SEM的分辨率已經(jīng)達到1 nm左右，足夠用來(lái)進(jìn)行外泌體尺寸的測量。TEM是把經(jīng)加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產(chǎn)生立體角散射。散射角的大小與樣品的密度、厚度相關(guān)，因此可以形成明暗不同的影像，影像放大、聚焦后在成像器件(如熒光屏、膠片、感光耦合組件)上顯示出來(lái)。

　　操作步驟大致是：

　　用PBS重懸提取的外泌體，滴于孔徑2 nm的載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置2 min，用濾紙從濾網(wǎng)側邊吸干液體，用3%磷鎢酸溶液在室溫下負染5 min，濾紙吸干負染液，室溫晾干，電鏡觀(guān)察拍照。外泌體在電鏡下具有非常明顯的膜邊界、呈30~100 nm大小不一的茶托或杯狀結構(也會(huì )有200 nm以下、較難鑒別的其他形狀的外泌體)，但電鏡對樣品的預處理和制備要求較高，樣品分離方法和樣品性質(zhì)可能影響電鏡結果的好壞；樣品的準備階段比較復雜，不適合對外泌體進(jìn)行大量快速的測量；且因外泌體經(jīng)過(guò)了預處理和制備過(guò)程，無(wú)法準確測量。

　　以上兩種方法是最常用的外泌體的鑒定方法，是展開(kāi)外泌體功能研究的前提。比如在腫瘤研究中，通過(guò)提取鑒定不同細胞系中的外泌體，進(jìn)而通過(guò)PCR以及測序篩選分析RNA，探究外泌體在腫瘤進(jìn)展或者耐藥中的發(fā)生機制。

　　外泌體像一把“雙刃劍”，與癌癥進(jìn)展有著(zhù)密切的聯(lián)系，參與促進(jìn)癌細胞的增殖與擴散，對癌癥的發(fā)生及惡化有著(zhù)重要的作用。但外泌體又可以應用于癌癥的診斷與治療，目前外泌體在癌癥診斷與治療中的應用尚處于初級階段，未來(lái)仍需要對外泌體的作用進(jìn)行更深入地探究，使其更好地應用于臨床。

　　03納米顆粒示蹤分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)檢測外泌體粒徑及濃度

　　在外泌體研究領(lǐng)域，NTA技術(shù)已被用作外泌體表征手段之一；相較于其他表征方式，NTA技術(shù)的樣本處理更簡(jiǎn)單，更能保證外泌體原始狀態(tài)，檢測速度更快。大致方法是：將收集的外泌體用PBS稀釋至106/mL，用1 mL注射器注入納米顆粒跟蹤分析儀(如裝有450 nm激光器的Nanosight NS300顆粒粒度分析儀)；激光光束穿過(guò)樣本室外泌體顆粒，通過(guò)裝有攝像頭的顯微鏡實(shí)現顆�？梢暬�，捕捉外泌體的布朗運動(dòng)，利用愛(ài)因斯坦方程式根據其運動(dòng)計算濃度和流體力學(xué)直徑。SBI公司新開(kāi)發(fā)的一種排除非外泌體顆粒干擾的試劑盒，還可幫助實(shí)現對完整外泌體的NTA分析。

　　04.流式細胞儀檢測外泌體的生物標志物

　　流式細胞儀檢測技術(shù)比較快速，適合高通量篩選，且可分析顆粒的大小與體積。用外泌體表面特異性標志物相應的抗體進(jìn)行標記，用流式細胞儀檢測其陽(yáng)性表達，從而驗證外泌體。如染色后的外泌體溶液加入分支聚乙烯亞胺(PEI)，37oC孵育15 min，之后超速離心去除PEI，然后加入金納米顆粒，輕柔重懸后置于培養箱中60 min，加入別藻藍蛋白(allophycocyanin,APC)DNA染料，室溫孵育15 min后流式細胞儀檢測。APC陽(yáng)性的顆粒即為所需檢測的外泌體。